原代細胞轉染的實用工具

生物通報道：現代分子生物學研究，很大程度上依賴于向細胞引入遺傳物質的能力。然而，要做到這一點并不那么容易，尤其是在細胞緩慢分裂甚至不分裂的情況下。原代細胞就是這樣一個轉染難題，不過人們已經為此開發了許多趁手的工具。

瞬時轉染很有用

將核酸送入細胞主要有三條途徑。一：屬于化學方法，旨在減少帶負電的細胞對帶負電核酸的排斥，促使細胞膜通過胞吞、胞飲或融合攝入附著其上的顆粒。二：屬于物理方法，包括電穿孔、顯微注射和基因槍、磁轉染等等。三：是利用病毒（或類病毒顆粒）來遞送核酸，這一過程也被稱為轉導。轉導是將DNA轉入細胞并使之表達的一種保險的方法，這種方法對操作者有較高的專業要求，比較耗費時間，而且存在一定的生物安全性問題。

人們總是希望能夠獲得穩定表達目的基因或轉錄本的細胞系。然而就算一切順利，建立這種穩定細胞系也是一項很麻煩的工程。含有目的基因的DNA要進入細胞核，整合到宿主基因組中（或者成為自我復制的附加體episome），并由此得到轉錄和翻譯。

完成上述步驟可能需要六到八周，而后才能進行抗生素篩選，研究者們通常會先用瞬時轉染試一試自己的質粒載體，“一般在轉染后48到72小時內就能看到蛋白表達，有時也會需要96小時，”Ovcharenko說。瞬時轉染可以幫助研究者們快速確定，細胞是否能夠很好的耐受質粒的編碼產物（蛋白甚至是miRNA）。

將mRNA或siRNA送入細胞（替代DNA質粒），能夠快速嘗試轉錄本在細胞內的效果，特別適合研究那些不分裂或者難轉染的細胞，例如神經元和原代T細胞。盡管瞬時轉染的效果可能只持續幾天，但RNA轉染起來要容易得多，因為它不需要進入細胞核就能夠發揮作用。（延伸閱讀：如何選擇siRNA轉染試劑）

穩定轉染的實用工具

要實現長期穩定表達，外源基因須能夠留在宿主細胞中并且與之一同復制。要在原代細胞中達成這一目標，標準方法是使用電穿孔進行轉染。不過，各大公司也為這些難以轉染的細胞，提供了多種可以實現穩定轉染的試劑和試劑盒。

Promega公司的FuGENE® 和Life Technology公司的Lipofectamine®已經成為了通用轉染試劑中的經典。其他通用型產品也層出不窮，比如Incella公司的ScreenFect®A和ATCC的TransfeX™。

許多公司還推出了專門為特定細胞類型量身打造的試劑和轉染方案。舉例來說，EZ Biosystems公司網站上列出了33種針對不同原代細胞的Avalanche™轉染試劑，從人動脈內皮細胞、尿道黏膜上皮細胞到小鼠胚胎成纖維細胞。Cell Applications公司的Cytofect™ 成纖維細胞轉染試劑盒，分別為原代的真皮、心臟和肺成纖維細胞提供了相應的優化方案。

“特別針對原代細胞的轉染試劑含有特殊的配方，而且經過了有針對性的測試和優化，能夠在維持細胞活力的同時提供好的轉染效率，”Bio-Rad公司的Teresa Rubio說。

不過，沒有哪個轉染試劑是萬能的，因此實驗室里能多做幾手準備�！笆聦嵣�，人們對細胞轉染的生化機制還沒有足夠的理解，無法根據制定的細胞和應用預測哪個試劑好用，”Incella公司的科學家Pavel Levkin坦陳�！耙虼�，如果想要獲得高的轉染效率，根據細胞類型進行優化是非常重要的�！�

一步一步來

Ovcharenko建議我們在轉染原代細胞之前，先選擇一組轉染試劑進行優化和比較，可以是通用型試劑也可以是專門針對特定細胞的轉染試劑�！叭绻�這些試劑的轉染效率都不理想，”他說�！澳敲淳蛻�該嘗試一下電穿孔�！�

市面上形形色色的電穿孔儀也不少，也都配備了各種相應的試劑。有些系統使用的預設程序，其他則大多是開放式系統，允許用戶對一些參數進行編輯。

“從結果的功能上看，現在市面上的電穿孔儀是非常相似的，”Thermo Fisher公司負責轉染產品的James Lovgren說。關鍵在于如何設定參數，“將核酸有效送入細胞，同時盡量減少對細胞的影響。只有二者達到一定的平衡，細胞才能在電穿孔處理中存活下來�！�

Alabama大學的Randy Cron教授用Nucleofector來轉染原代T細胞。這一系統可以在細胞質和細胞核的膜上打孔，他解釋道。這樣有利于把核酸送入細胞核，但也會影響到鈣離子流量，提高CD4+ T細胞活化標志的表達。Cron提醒其他用戶在設計實驗和解讀結果時注意這一點。

如果電穿孔也無法達到足夠的轉染效率，“那就只能用上我們的病毒載體，”Ovcharenko說。雖然病毒遞送的效率高，但這種方法需要大量的克隆和優化工作，還要采取相應的安全防護措施，其他方法都沒這么麻煩。

在原代細胞中實現外源基因的長期穩定表達，一直是個很棘手的工程，但我們也不必因此而灰心喪氣。前輩們已經為此作了大量的工作，查查文獻和供應商提供的資料往往會讓我們獲益匪淺。