流式細胞儀的發展歷史及其原理與應用進展(流式細胞儀,發展歷史,原理,應用進展)

 流式細胞分析（flow cytometry，FCM）即流式細胞術，是用流式細胞儀（flow cytometer，FCM）測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術。它凝結眾多不同學術背景、不同科研領域研究人員的心血。從流式細胞術的發明、發展直到今天在各個領域應用的拓展，每一步都是諸如電子技術、流體力學、計算機科學、激光技術、生物學、生物技術、高等數學、臨床醫學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結晶�，F代流式細胞術更是由于它結合單克隆抗體技術、定量細胞化學技術和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發展。流式細胞術的發展史也就是各個相關學科的發展史的縮影。

1、流式細胞術的發展歷史

1930年，Casperrsson和Thorell開始致力于細胞的計數；1934年，Moldaven是設想使細胞檢測自動化的人，他試圖用光電儀記錄流過1根毛細管的細胞數量；1936年，Caspersson等引入顯微光度術；1940年，Coons提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內的特定蛋白；1947年，Guclcer運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數器；1949年，Coulter提出在懸液中計數粒子的方法；1950年，Caspersson用顯微分光光度計在紫外（UV）和可見光光譜區檢測細胞；1953年，Croslannd Taylor應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自動計數器；1953年，Parker和Hutcheon描述一種全血細胞計數器裝置，成為流式細胞儀的雛形；1954年，Beirne和Hutchcon發明光電粒子計數器；1959年，B型Coulter計數器問世；1965年，Kamemtsky等提出兩個設想：(1) 用分光光度計定量細胞成分； (2) 結合測量值對細胞進行分類；1967年，Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基礎上提出細胞分選的方法；1969年，Van Dilla Fulwyler及其同事們在LosALmos，NM（即現在的National Flow Cytometry Resource Labs）發明熒光檢測細胞計；1972年，Herzenberg研制出一個細胞分選器的改進型，能夠檢測出經熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號；1975年，Kochler和Milstein提出單克隆抗體技術，為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎�，F今隨著光電技術的進一步發展，流式細胞儀已開始向模塊化發展，即它的光學系統、檢測器單元和電子系統都可以按照實驗要求隨意更換。進入21世紀，流式細胞術已經日臻完善，成為分析細胞學領域中無可替代的重要工具。

2 、流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀主要由4部分組成：液流系統、光學系統、電子系統、分析系統。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，用不含細胞或微粒的緩沖液（又稱鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度，使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動，形成一個圓形的流束（即鞘流），待測細胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細胞儀的檢測區域，經激發光激發后產生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發光源，經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管（PMT）接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，稱為前向散射（forward～atter，FSC），這種信號基本上反映細胞體積的大��；90°散射光又稱側向散射（side scatter，SSC），是指與激光束-液流平面垂直的散射光，其信號強度可反映細胞部分結構的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內、核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機采集所測量到的各種信號進行計算處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上，以備日后的查詢或進一步分析。檢測數據的顯示視測量參數的不同而有多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其x 軸為測量的散射光或熒光的強度（可以是線性軸，也可以選擇對數軸），縱軸為相對細胞數。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有256或1024通道數，這視其模/數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的散點圖、等高線圖或三維的立體視圖等。

流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取，它通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體，可以產生高頻振蕩，使液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷，當帶電液滴通過電場,在電場的作用下發生偏轉，然后落入相應的收集器之中，從而實現細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000個/s提高到現在的25000個/s。

流式細胞術發展趨勢可歸納為：①流式細胞儀從單純大型儀器發展為適應各種實際應用的便攜式、臺式、高分辨率、高質量分選的研究型流式細胞儀；②對流式細胞術檢測熒光參數，從采用熒光單色、雙色分析發展為多色分析，目前可同時檢測15種熒光信號；③從檢測參數的相對定量發展為絕對定量；④從檢測參數的手動人工分析發展為利用計算機軟件的自動分析； ⑤所采用的熒光試劑，從非配套試劑發展為配套的試劑盒試劑。而這一切，就要求流式細胞儀使用者和科研人員，一定要不斷地有意識地學習上述各門學科知識，只有這樣才能更好地將流式細胞術應用到生物醫學的臨床實踐和基礎科學研究工作中去。

3 、流式細胞術的應用

流式細胞術的應用，簡單用一句話概括就是，凡能被熒光分子標記的細胞或微粒均能用流式細胞儀檢測。其中細胞生物學領域是流式細胞術在基礎研究中應用范圍廣泛的領域，因為當初這個技術就是為此目的而設計的。

3.1 流式細胞術在細胞生物學中的應用

3.1.1 染色體核型分析用流式細胞術可將分離的染色體進行分類、純化。傳統的核型分析在取材、培養、涂片、固定后，用分帶技術顯示出不同染色體的特征信息，然后再顯微照相，放大、剪接、組型。這是一個十分費時且不可避免摻有主觀因素的技術。目前，用儀器自動分型的方法，一是采用圖像技術的靜態方法，再有就是采用流式細胞術。后者除可做染色體分析外還可純化，得到克隆實驗所要求的染色體，這是其他任何技術都無法完成的，為此設計的特種流式細胞計。

3.1.2 在分子遺傳學領域中的應用流式細胞術的分析功能和分選功能在分子遺傳學領域很有用處。分析的功能常用來研究分離的染色體，有時也用來檢測或定量測量細胞表面或內部為特異基因所編碼的細胞分子；分選的功能可用來分選指定的染色體，然后用來建立人類染色體DNA文庫。

3.1.3 用于家畜性別的預選擇將家畜的X、Y精zi分選出來，達到控制胎畜性別的目的。此外，在精zi發生學、睪丸瘤、不育癥、藥物對精細胞的干擾等研究中，都可使用流式細胞術進行定量研究。

3.1.4 在微生物學中的應用流式細胞技術在真核細胞生物學方面，特別是哺乳類細胞學方面有重要貢獻，在微生物學方面的應用則發展相對較晚。實際上，微生物學，尤其是細菌學當前面臨的一些問題，特別是需要對大數量細菌進行逐個的快速多參數精確測量時,流式細胞術很適合解決此類問題。已發表的論文多數是針對酵母菌和各類細菌的測量與分析。酵母菌的測量在技術上比較簡單，它自身體積大，其DNA含量約為人類二倍體細胞DNA含量的1/200。已用定量DNA、RNA和光散射方法研究酵母菌的細胞周期。用同樣方法和目的，也對原生生物、藻類和霉菌類以及各種重金屬對其的影響進行研究。另外用FITC結合的抗血清可作種系鑒別，應用此項技術已能代替臨床上經典的費時繁瑣的細菌抗生素(antibiotic)敏感試驗和傳染活性的測定。在工業中，流式細胞術可用于快速微生物鑒定，如對飲用水及原油中的微生物學鑒定與控制。

3.1.5 在細胞周期研究中的應用在生物細胞核中，DNA含量并非恒定，隨細胞增殖周期時相不同而發生變化。G0期是一次細胞分裂(cell pision)完成后進入二次分裂開始前的階段。G0期細胞是不參與細胞增殖的一群細胞，為靜止期細胞，其細胞DNA含量為較恒定的二倍體（diploid）。G1期指二次分裂開始到本次DNA復制之前的過程，此期主要功能是積累能量和原料為DNA的復制做準備，故又稱DNA合成前期。G1期細胞具有增殖活性，開始有RNA的合成；G0期和Gl期是細胞處于周期過程中兩種不同功能狀態時相的細胞，不能視為同一細胞，但就DNA含量而言，兩者相同，均為二倍體DNA含量。S期又稱DNA合成期，合成及復制DNA。當細胞進入S期后，DNA含量值逐漸從二倍體～四倍體增加，直到細胞DNA倍增結束，進入G2期。G2期指從DNA復制完成到有絲分裂開始的時間區間，又稱DNA合成后期或有絲分裂前期，此期合成大量蛋白質，為M期的細胞分裂(cell pision)做準備。經過G2期后細胞進入M期，即有絲分裂期。在M期分裂為兩個子細胞之前，G2期和M期的DNA含量均為恒定的四倍體細胞群。FCM分析細胞周期與DNA倍體時，需對DNA進行染色。DNA熒光染料與細胞DNA雙鏈的結合有一定量效關系，即DNA含量的多少與PI結合量成正比，因此通過熒光強度可以反映細胞內DNA的含量。

3.2 流式細胞術在醫學中的應用

3.2.1 在免疫學中的應用隨著單克隆抗體技術、熒光色素化學等技術的發展,流式細胞術成為當代新技術的“雜交體”。正像免疫學作為一種不斷發展的學科和技術手段延伸到生物、醫學及其他領域一樣，流式細胞術也以它的快速、靈活和定量的特點，廣泛地被應用于免疫理論研究和臨床實踐應用的各方面，所以有人稱之為現代免疫技術基石之一。尤其同單克隆抗體結合應用，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監督、機體免疫狀態的監測、免疫細胞的系統發生及特性研究等方面都起著相當重要的作用。隨著細胞學、病理學、免疫學、腫瘤學研究發展的需要、流式細胞測定技術也不斷得到充實和完善。它不僅在功能上作為熒光顯微鏡的補充，而且因具備二者的全部功能和特點，從而在免疫及有關各學科領域發揮出更重要的作用。

20世紀80年代中期，國際上提出的白血病MIC分型法，標志著流式細胞儀及免疫分型在白血病診斷中的廣泛應用。我國自80年代中期引進該儀器，90年代迅速發展，現在已得到普遍應用。這期間免疫標記方法已發生很大的變化，由開始的主要采用間接免疫熒光標記法到直接免疫熒光標記法，從單色或雙色到利用CD45抗體標記設門法進行多色免疫標記，使免疫分型的準確性得到很大的提高；現在已成為診斷白血病不可缺少的工具。同時淋巴瘤的免疫分型與白血病免疫分型一樣也已得到廣泛開展。在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中FCM也發揮極大的作用。它通過對外周血中的CD4+T淋巴細胞進行絕對記數，來反映病情進展及監測療效。

3.2.2 流式細胞術在腫瘤學上的應用利用FCM進行細胞周期分析、DNA倍體分析、定量分析檢測細胞增殖標志物、細胞表面標志、癌基因蛋白產物、耐藥蛋白、細胞凋亡(Apoptosis)等，從而獲得組織形態學方法難以得到的信息，可為腫瘤的臨床診斷、治療和預防提供幫助。對腫瘤細胞DNA含量作定量分析，解析細胞周期，通過細胞異倍體測定預測各種腫瘤的預后，并能在化療中對藥物的選擇和放療中強度、時間的決定等起指導作用。解析抗癌藥物作用機制，對癌癥(cancer)進行早期診斷(early diagnosis)及鑒別良惡性有一定參考價值。此外，由于FCM對凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也發揮著重要作用，近年來引起腫瘤研究者的極大關注，已廣泛應用于腫瘤基礎和臨床研究中，為腫瘤診斷、療效評價和預后預測提供重要參考指標。另外，傳統的細胞形態學至今仍是診斷腫瘤的一種重要的手段。多年來，細胞學工作者就設想使腫瘤細胞學診斷自動化，流式細胞術的問世，使細胞學檢查自動化的宿愿如愿以償，并已廣泛應用于腫瘤臨床細胞學的診斷研究。

大量的臨床應用表明，流式細胞術對腫瘤細胞學的診斷正確率已達常規細胞學診斷水平。腫瘤細胞對化療藥物的耐受性是腫瘤治療的主要障礙。腫瘤細胞的耐藥性可分為原發耐藥和繼發耐藥，前者在化療前就存在于腫瘤細胞中，與用藥無關，后者是由化療藥物誘導產生的，即在藥物使用前對藥物敏感，而在用藥之后產生耐藥。繼發耐藥根據耐藥譜的不同又可分為原藥耐藥（PDR）和多藥耐藥（MDR）。MDR相關蛋白包括P糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等。它們都屬于ATP酶活性轉運蛋白，均是通過藥物外排泵的作用降低細胞中藥物的聚集。因此應用FCM檢測腫瘤細胞的多藥耐藥相關蛋白的表達水平，對監測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定意義。

3.2.3 在血液學研究中的應用除上述FCM在白血病及淋巴瘤的免疫分型應用之外,它在血液學研究中有廣泛的用途。如血小板記數、血小板自身抗體測定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析等。紅細胞表面相關免疫球蛋白測定、紅細胞血型抗原分析等。

3.3 流式細胞術新技術的應用

3.3.1 液相芯片技術生物芯片技術是近年來隨著人類基因組計劃(genome project)和蛋白質組計劃的進展在生命科學領域中迅速發展起來的一項技術，現已被大家所熟知。將生物芯片技術和FCM有機結合在一起，把不同生物探針（核酸、蛋白等）標記在各種有熒光的微球上，以熒光標記微球作為反應載體在液相系統中完成生物學反應，即為流式細胞術液相芯片技術。它組成由微球體+探針+目的分子+報告分子的一種簡單反應模式�？梢栽谕�一液相中同時檢測多個目的分子。如對血液中多種白細胞介素檢測。

3.3.2 定量流式細胞分析定量流式細胞分析（quantitative flow cytometry ，QFCM）是指用流式細胞術對細胞或微粒上標記熒光分子的定量分析，從而對細胞的生物分子進行精確測量。如每個分子表達的平均分子數、抗原數等。定量流式細胞分析不同于以往的相對熒光強度或陽性細胞百分率測量，它更為準確、靈敏，為FCM的發展趨勢。如在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中，對外周血中的CD4+T淋巴細胞進行絕對記數，來反映病情進展及監測療效�？傊�，流式細胞術應用極為廣泛，本文所介紹的也只是其中一部分。隨著當今各項科學技術的迅猛發展,流式細胞術會有更加廣闊的應用前景。